翻译方面，环形RNA跟线性RNA有两个不一样。第一个是环形RNA不用进行修饰 （modification），就可以用编码。第二个，它的翻译方式不一样，环形RNA是非帽依赖型的翻译，而mRNA是帽依赖型翻译。环形RNA翻译它是会受体内的RNA结合蛋白来调控，而线性RNA是不受这调控的。换一句话说，把线性RNA打进细胞里，不管什么细胞，它基本上都会被翻译。但是把环形RNA打在不同的细胞里，它的翻译活性是不一样的，同样的环形RNA它的翻译更有一些细胞特异性。这样给我们多一层的控制空间，我们可以在递送以外，还可以做很多设计的东西。环形RNA更稳定，就可以用很少的量把环形RNA的翻译效率提高到线性RNA的水平。

 

非翻译的方面，其实环形线性其实都是RNA。大家很多情况之下用线性RNA做的很多事情，用环形RNA也可以做。不要把线性还是环性看得那么重要，环性也只不过相对稳定一点而已。

78年哈佛医学院的教授发现ASO可以终止翻译，其实是下调蛋白的作用后，他觉得这个可以作为药物来开发。早期发现ASO有一个比较明显的特点，因为它特别短，当时只有十几个碱基，所以它在体内非常不稳定，基本上进去后很快就被核酸酶降解掉，所以在成药上非常困难。

 

一直到1989年Ionis公司成立，专门研究解决ASO体内稳定性问题，他们通过化学修饰的方法来解决稳定性问题，主要是为了抵御核酸酶的降解作用。

 

90年代发现，因为核酸都是磷酸酯，如果把磷酸中的氧用硫替代后，它的稳定性就提高了，核酸酶就降解不了，后面逐渐作为药物来开发。

 

直到1998年，采用PS修饰的第一个反义寡核苷酸的药物就上市了，适应症主要是针对巨细胞病毒视网膜炎，但是2002年退市。在这里面也发现一些问题，虽然进行PS修饰稳定性大大提高，但是由于硫原子的亲和性比较强，所以它在肝脏里面蓄积性也非常严重，会造成一定的肝毒性。这个导致ASO研发低谷，很多公司退出，但是Ionis公司坚持下来，他还想通过更多的修饰方式来进一步提高它的安全性。在2006年-2010年时候，他发现在核糖体（Ribosomes）的二撇位进行修饰，它的稳定性得到提高，蛋白结合率也很高。

 

已上市的核酸药物，不管是ASO还是干扰RNA 它的修饰主要都是两种，就是氟代和帽或者甲氧基修饰的。

 

大概 2010 年前后，也是Ionis的科学家，通过剪切调控ASO的方式也取得了很大的进展。2016年第一个剪切调控的药物Spinraza上市，现在已经上市的 ASO 的药物一共有 9 个，其中5个都是采用了空间位阻的方式。

 

整体的核酸药物里面，从研发的历史上成药性的角度，ASO研究时间比较长，在修饰突破也比较多，目前上市最多，销售额也是最多的。像Spinraza每年差不多20多亿美金。随着到2000年以后，通过锁核酸修饰的方法，它的稳定性问题和毒性问题基本都得到解决了。

 

由于它原先主要是依靠细胞内吞类似于一种被动靶向的方式进核，所以它的递送效率并不高，其实现在它的问题逐渐转移到递送上来。现在你会看到在后期临床，比如二期、三期临床里，它借鉴了很多类似mRNA类型和siRNA 递送的技术来进一步提升它的递送效率。

第三代小核酸递送系统的原理：打进去一个小RNA的前体质粒（plasmid），在肝脏内，它不仅能够表达出治疗用的小RNA并且肝脏细胞本身就是一个细胞工厂，它能够把内源性产生的治疗用的小RNA和蛋白复合物结合到一起后，再包裹进外泌体。外泌体分泌出去后就能进入循环输送我们所需要的小 RNA到相关的组织和细胞中去，由于它在分泌的时候都已经和蛋白复合物结合到一起，所以它在靶细胞靶器官释放出来，就能以极低浓度起作用。

 

第一代小核酸递送系统是用合成或化学修饰的方式，使它稳定，直接打；第二代用体外外泌体、纳米颗粒、脂质颗粒输送，但是输送的只是“子弹”。但是我们在体内自组装产生的治疗性小RNA，实际上现在主要我们用的是siRNA，靶向特定的是癌基因或者致病基因。我把它比喻成，它输送的是一个“上了子弹上了膛的枪”，所以更有效。另外质粒的生产和工艺是非常成熟的，QC也更好把握，这就是第三代小核酸递送系统的原理。

mRNA最大的问题它是不是很稳定，尤其体外合成的mRNA，所以为了提高mRNA的稳定性，通常序列设计的时候要加很多RNA的结构进去，但加RNA的结构后，这种mRNA相对结构少的mRNA就相对稳定一些。因为有结构的mRNA，细胞会把它认为是病毒来的RNA，那么它就会有天然免疫反应来攻击结构mRNA，所以它会诱导细胞免疫反应。细胞免疫反应最典型的结果就是它把所有的翻译都抑制了，细胞就会就会死掉，在这种情况之下，副作用就非常大。

 

副作用这个问题困扰领域非常多年，一直到Drew Weissman在2006年发现RNA进行修饰后，就可以把天然免疫原性降下去。Moderna发现RNA加个帽子，加个修饰以后它就相对稳定，可以被翻译。但是生产又有问题，因为加了修饰的碱基，从DNA往RNA生产转录就是个问题，转录效率非常低。Moderna就加了很多工程化的酶可以生成带修饰的RNA，更加稳定，不会产生免疫原性，这就是它的技术壁垒。

 

对于环形RNA，它第一个就是稳定，不需要进行修饰，免疫原性就低。可以绕开mRNA很多问题。同时因为环形RNA稳定,所以用它来做mRNA药物，它的治疗窗口非常好，这样在mRNA不好用的情况下，环形RNA就是可以做。

最开始我们发现环形RNA，是因为做EST测序的时候会看到很少，因为大部分人做这个测序的时候，它是要用poly(A)来建库，所以富集大部分是线性RNA，其实环形RNA很多，但是没发现。一直到2010年-2011年左右，大家发现环形RNA到处都是。

 

环形RNA，它的功能其实有很多不一样的地方，我们现在基本上把它分成两类，一种是主动功能，一种是被动功能。主动功能和被动功能是指可以发生编码功能和非编码功能。被动功能是指环形RNA它的序列跟线性的基因很多地方是重合的，线形RNA可以结合一些，比如MicroRNA，环形RNA也可以，这样环形RNA就成为线性RNA的竞争物，它存在于体内，但它很多情况下有的量高，有的大部分量低，在里面起到调节作用，我称这个是被动功能。

 

但我们实验室认为它是可以进行编码功能，就是天然环形RNA是可以进行编码功能。我们在2015年初证明了环形RNA可以编码,加一段IRES就可以。为了翻译功能99%的RNA需要添加5’的帽子（cap），都是帽子依赖型翻译（cap-dependent translation）。

 

而对于环形RNA或者一些病毒（virus）可以不从头开始翻译，从中间开始翻译。我们证明在环形RNA里面，如果它有IRES元件（Internal Ribosome Entry Sites）这就可以从中间开始被翻译。

 

后来新冠疫情来了，环形RNA突然火起来，大家都认为环形RNA比mRNA稳定，可以代替成下一代mRNA。