第一，整个mRNA甚至是pre-mRNA，所以其实这里面就是你去结合哪一个序列会效率最高，其实ASO的筛选和设计的问题，对于ASO是比较大的一个挑战。

 

第二个，递送方面，现在看上市ASO药物都没有用递送系统，因为它本身通过内吞能进去，但这是好事。另一方面，当初研究不足的地方，就是它在递送上下的功夫是不够的，一般给药剂量都偏大。所以现在也借鉴了很多，就是mRNA、siRNA上的一些递送，比如GalNAc肝靶向递送，但是这种对于非肝的组织器官没有好的方法。ASO 一般对于肝靶向可以借用GalNAc。另外一个对于可以局部注射的，通过局部溶度提高，可以实现。但是对于不是局部也不是肝脏的，现在还在探索中。

对于非编码小RNA，靶点都是mRNA。而现在绝大部分的小分子和抗体，它的靶标都是蛋白质。对于靶标为蛋白质的这些药物开发，现在已经遇到了瓶颈，小分子的筛选是个问题，蛋白质的动态结构也是问题。

 

对于蛋白质来说，无论是小分子，无论这是抗体，它另外还有两大问题，第一个是通过体内屏障问题，比如血脑屏障。第二个问题是对于蛋白质，它有特定的结构，小分子或者抗体好，是认识的这种特定结构。如果有碱基使得氨基酸突变后，现在小分子和抗体就不能作用。

 

自从有ASO、siRNA、MicroRNA，我们针对的不是蛋白，是在蛋白前头的mRNA。第一，对于mRNA的序列很容易走。第二，以两个碱基序列改变能够造成蛋白结构大的改变，使得小分子抗体药物无效，但是在小RNA药物上不存在这个问题，不容易产生耐药性。第三个，原来不能成药的病理性驱动（driving）基因，通过target它的mRNA都能成药。mRNA药物还有一个好处，对于多基因复杂性状的重大的疾病，现在无论是小分子还是抗体药都做不到多靶点target这些病理性蛋白，对于小RNA我们在一个合成生物学基因组件上能够放5个不同的靶点的 siRNA。

翻译方面，环形RNA跟线性RNA有两个不一样。第一个是环形RNA不用进行修饰 （modification），就可以用编码。第二个，它的翻译方式不一样，环形RNA是非帽依赖型的翻译，而mRNA是帽依赖型翻译。环形RNA翻译它是会受体内的RNA结合蛋白来调控，而线性RNA是不受这调控的。换一句话说，把线性RNA打进细胞里，不管什么细胞，它基本上都会被翻译。但是把环形RNA打在不同的细胞里，它的翻译活性是不一样的，同样的环形RNA它的翻译更有一些细胞特异性。这样给我们多一层的控制空间，我们可以在递送以外，还可以做很多设计的东西。环形RNA更稳定，就可以用很少的量把环形RNA的翻译效率提高到线性RNA的水平。

 

非翻译的方面，其实环形线性其实都是RNA。大家很多情况之下用线性RNA做的很多事情，用环形RNA也可以做。不要把线性还是环性看得那么重要，环性也只不过相对稳定一点而已。

78年哈佛医学院的教授发现ASO可以终止翻译，其实是下调蛋白的作用后，他觉得这个可以作为药物来开发。早期发现ASO有一个比较明显的特点，因为它特别短，当时只有十几个碱基，所以它在体内非常不稳定，基本上进去后很快就被核酸酶降解掉，所以在成药上非常困难。

 

一直到1989年Ionis公司成立，专门研究解决ASO体内稳定性问题，他们通过化学修饰的方法来解决稳定性问题，主要是为了抵御核酸酶的降解作用。

 

90年代发现，因为核酸都是磷酸酯，如果把磷酸中的氧用硫替代后，它的稳定性就提高了，核酸酶就降解不了，后面逐渐作为药物来开发。

 

直到1998年，采用PS修饰的第一个反义寡核苷酸的药物就上市了，适应症主要是针对巨细胞病毒视网膜炎，但是2002年退市。在这里面也发现一些问题，虽然进行PS修饰稳定性大大提高，但是由于硫原子的亲和性比较强，所以它在肝脏里面蓄积性也非常严重，会造成一定的肝毒性。这个导致ASO研发低谷，很多公司退出，但是Ionis公司坚持下来，他还想通过更多的修饰方式来进一步提高它的安全性。在2006年-2010年时候，他发现在核糖体（Ribosomes）的二撇位进行修饰，它的稳定性得到提高，蛋白结合率也很高。

 

已上市的核酸药物，不管是ASO还是干扰RNA 它的修饰主要都是两种，就是氟代和帽或者甲氧基修饰的。

 

大概 2010 年前后，也是Ionis的科学家，通过剪切调控ASO的方式也取得了很大的进展。2016年第一个剪切调控的药物Spinraza上市，现在已经上市的 ASO 的药物一共有 9 个，其中5个都是采用了空间位阻的方式。

 

整体的核酸药物里面，从研发的历史上成药性的角度，ASO研究时间比较长，在修饰突破也比较多，目前上市最多，销售额也是最多的。像Spinraza每年差不多20多亿美金。随着到2000年以后，通过锁核酸修饰的方法，它的稳定性问题和毒性问题基本都得到解决了。

 

由于它原先主要是依靠细胞内吞类似于一种被动靶向的方式进核，所以它的递送效率并不高，其实现在它的问题逐渐转移到递送上来。现在你会看到在后期临床，比如二期、三期临床里，它借鉴了很多类似mRNA类型和siRNA 递送的技术来进一步提升它的递送效率。

第三代小核酸递送系统的原理：打进去一个小RNA的前体质粒（plasmid），在肝脏内，它不仅能够表达出治疗用的小RNA并且肝脏细胞本身就是一个细胞工厂，它能够把内源性产生的治疗用的小RNA和蛋白复合物结合到一起后，再包裹进外泌体。外泌体分泌出去后就能进入循环输送我们所需要的小 RNA到相关的组织和细胞中去，由于它在分泌的时候都已经和蛋白复合物结合到一起，所以它在靶细胞靶器官释放出来，就能以极低浓度起作用。

 

第一代小核酸递送系统是用合成或化学修饰的方式，使它稳定，直接打；第二代用体外外泌体、纳米颗粒、脂质颗粒输送，但是输送的只是“子弹”。但是我们在体内自组装产生的治疗性小RNA，实际上现在主要我们用的是siRNA，靶向特定的是癌基因或者致病基因。我把它比喻成，它输送的是一个“上了子弹上了膛的枪”，所以更有效。另外质粒的生产和工艺是非常成熟的，QC也更好把握，这就是第三代小核酸递送系统的原理。