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分享毕赤酵母细胞工厂构建及药物合成应用
蔡孟浩
毕赤酵母细胞
药物合成
2022-12-15
a、巴斯德毕赤酵母发现历史：
最早是在1920年的时候，法国科学家第一次发现了这种类型的酵母。1956年美国科学家Herman Phaff在加州的一个橡树里，分离到了4株酵母的菌株。上个世纪60年代，日本科学家Koichi Ogata发现能以甲醛作为唯一碳源的酵母就称之为甲醛酵母。1970年代，美国Phillips Petroleum Company成功开发了培养基及方法用巴斯德毕赤酵母高密度培养生产饲料用单细胞蛋白(SCP)。
1980年代初，Phillips Petroleum Company 与 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Inc.(SIBIA)开始联合开发毕赤酵母表达系统
SIBIA公司的研究人员Ellis等1985年首次成功分离了甲醇氧化酶（AOX1）基因及其启动子，这个启动子也是目前在我们行业领域内包括制药、食品、农业等做表达系统里面最常用的非常强的启动子体系。1985年，Jim Cregg等首次报道用巴斯德毕赤酵母作为宿主表达外源蛋白成功。
1995年，Yuzo Yamada等将其重新归类于新属 Kormagataella。2005年，Cletus P Kurtzman将Komagataella分类于多个种，原来的巴斯德毕赤酵母随即被重新鉴定为其实是两个种。
b、巴斯德毕赤酵母特性：
首先它密高密度生长，能支撑它能够产生足量的蛋白。从工业的应用角度，培养基很简单，下游的分离纯化是非常方便，发酵工艺也很成熟，发酵放大的整体也非常方便。从遗传的角度，整合型表达，外源基因遗传稳定。具有蛋白磷酸化、糖基化等翻译后修饰功能和高效、严谨的启动子系统，不管它在细胞内去生产蛋白，还是把蛋白分泌到细胞外，都有非常强的表达能力，可以用于不同的需求。巴斯德毕赤酵母是应用最为广泛的外源蛋白真核表达系统。
c、巴斯德毕赤酵母在不同领域的应用：
首先巴斯德毕赤酵母它已经被美国的FDA认定为一般认可安全菌株，它可以用于药品和食品重组表达领域的应用，所以这也是非常有利的认定，可以拓展它的应用范围。毕赤酵母官网介绍，已经有5000多个外源蛋白，70多个商业化产品，300多个工厂许可证，20多个治疗用生物制品。
毕赤酵母现在有20多个上市的药物，特别是在2020年2月，丹麦的灵北公司第一次报道了FDA获批的抗偏头痛药物，这个药物是一个单克隆抗体。单克隆抗体绝大部分是用动物细胞的方式来生产，这次获批后引起了酵母领域的轰动，单克隆抗体完整分子可以用酵母形式来生产。
第二个引起广泛关注的上市获批的产品，在食品领域用毕赤酵母产生了大豆血红蛋白，用于人造肉里，让它具备肉味。
其实很多产物合成的路径也打通，这就意味着这个酵母它可以很好地去利用廉价的甲醛碳源，合成一系列的大分子酶，复杂结构的生物材料，还有一些化学品，包括一些大宗的药物分子等。因为甲醇它本身也有很高的还原度，整体的还原程度要比葡萄糖多出50%，这对于小分子化合物的合成是非常有利的。
从大宗的食品和生物药的制造，它如果用甲醇，呈现的劣势就更加明显一些，但是如果我们把它用到化工领域，大宗的化学品，一些生物基材料，包括大宗的原料药的分子等，它的成本优势、还原度、来源广泛的优势就体现的会更多。所以我们要根据具体情况进行分析。
d、毕赤酵母在食品和生物药领域存在的问题：
首先甲醇其实是易燃易爆的化学品，在大规模应用的时候涉及到防爆设计问题。第二个它从调控机制上是不太清楚的，它实际上对细胞本身而言还是有一些毒性的。从另外一个角度上，它整体的改造和调控非常困难。
e、毕赤酵母新型表达系统的设计：
基于这些问题，我们希望把它改造成能够按照我们人为的想法和模式更容易控制的新的表达体系。
一代系统里可以实现无甲醇的体系。一代系统，我们虽然实现了无甲醇，但是它实际上表达能力上还是没有野生型的高，又做了一系列的改造。
二代系统，无甲醇强诱导型底盘，用了很典型的合成生物学的遗传线路设计的理念，把它的转录因子还有启动子做了一系列的改造，从而通过人工招募的方式，来启动外源基因的表达。突破了甲醇启动子的碳源阻遏，实现灵活调控。
二代系统依旧存在一个问题，把它表达能力的上限提高提到了很高的水平，但实际上把它渗漏表达的底线也给它拉升了。这对宿主不友好的蛋白，菌在生长的时期，产物已经在合成了，这样菌就会长不起来，整个发酵过程就会失败。
三代系统，自定义信号强诱导底盘。
从合成生物学整个领域上，它有非常大的想象空间，也有巨大的开发潜力。不管是在学术领域，还是在真正的产业界里，其实它都会有非常大的空间。
注射用凝胶国内外的研发情况，什么类型的项目适合注射用凝胶？
刘荣
注射剂
注射用凝胶
2022-12-14
在1998年在国外就有产品上市，多西环素，用于治疗牙周炎7天细菌的抑制。在2002年亮丙瑞林的原位凝胶上市，用于性早熟。从治疗领域，有一个药叫做丁丙诺啡，是用于戒毒的，一个月一针皮下注射。接下来是利培酮，属于精神类的。
所以注射用凝胶的适用范围很广，包括术后、化疗后的止吐，格拉司琼在2016年就上市了，扎一针有7天的止吐效果。止痛止疼方面，2021年，FDA批准了布比卡因美洛昔康复方的凝胶，72小时以后起到非常好的止痛效果。同年另外一个醋酸亮丙瑞林，美国FDA也批准了，它是一个皮下注射的产品，达到6个月一针。
如果确实有长效的临床需要，凝胶也是很好的载体。
凝胶突出的优势是，在凝胶前体以前可以通过一些导管、针头微创的形式进入体，目前用的比较多的是皮下注射，减少了很多病人的痛苦，如果用植入，对病人来说还是比较容易接受的剂型，还有一些其他的优势，包括用药周期比较灵活，从短期到长期的需求，它都能根据处方的设计，用的物料不一样，都能达到这个目的，剂量也可以调节。
一般凝胶含药量很少会超过300毫克，它的适用范围，从药物分子来说，不管比较大的分子量，还是比较小的分子量，易溶还是难溶的一些化药或者多肽都可以用凝胶形式做成制剂。对于微球等，相对比较简单，重复性比较高，产业化成本也比较低。
从做微球转做mRNA这块,微球和mRNA的LNP技术的对比
吕丕平
微球
微球制剂
2022-12-14
从CMC制剂工艺来说，两者还是有很大的相通性，因为本身都属于复杂制剂。
LNP相比于微球来讲，它的质控可能更简单，因为微球的话它要求全程防护，从投料开始要做人员防护，一直到生产结束，这个过程是要全程防护的。LNP在最初投料的时候可能做一些防护，就看自己的API是不是细胞毒的，这类的API可能就要做些防护。这个过程比微球操作更方便一点。
目前LNP这类制剂很多都是做冻干的，整个的冻干过程，LNP里的水分控制和微球里的水分控制极其相似。
微球毕竟主要以二类改良为主，它很少去做全新化合物的新型制剂。但是mRNA不一样。它上游这块还是要考虑，从种子库的建立我们就要做一个质控。微球就不考虑API的整个开发过程。
所以综合对比，微球制剂的技术难度更大。LNP的制剂技术难度小一些，但是整个工艺流程，微球从配液开始，但是LNP这类产品，它要从目标序列设计开始，一直到下游整个结束。
梳理纳米晶从研发、生产、临床、上市过程的壁垒
何军
纳米技术
纳米胶束剂型
2022-12-14
a、首先就是原料药。
第一个，原料药的力度和晶型肯定是我们要去关注的。晶型是贯穿在整个制剂当中，甚至到成型的制剂后，我们也要关注可能存在的晶型变化。所以原料药需不需要修饰，可能溶解度是一个方面，可能对于晶形或者其他物理性质的改变，可能也是我们需要去关注的。而现在我们做研究当中，其实对于前要的修饰，我们常规的认为是降低溶解度方面，我觉得还不应该局限在这个层面上。
第二个，对于原料药，如果是进行修饰，我们用多长的链来进行修饰，这也是值得深思的问题。在我们创新过程中，我们发现不同脂肪酸长链的修饰，其实药物的理化性质可能会有比较大的差异，包括它的结晶形式。
b、研发过程中
研发出来的产品怎么进行质控，这也是一道坎。因为现在没有非常好的微观评价手段，去评价粒径的均一性或者大小，很多都是要通过药代动力学参数来对粒径进行评价。特别是在做仿制过程中，其实纳米晶磨下来后，它是有一定的粒径分布范围，如何去评价粒径分布范围与参比制剂基本一致或者完全一致。
第二个，对于体外评价上，纳米晶现在借鉴的是微球的一些评价方法来对它的体外特征进行评价，但是合不合适？
纳米晶结构的外观形式，片状、颗粒状、不规则球状或者类似这些形状，都有可能对于它的释放会产生一些影响。这些微观水平，我们只有从多个角度或者多个纬度上看这个事情，才可能真正理解这个品种的特点，这也是我们现在存在的障碍。
c、生产过程中
第一个瓶颈就是无菌度的问题。
其次就是在碾磨过程中，碾磨的时间，，碾磨的次数。如果用高压匀质，可能还有高压匀质的压力，这是我们要去着重考虑的一些参数，如何保证罐装前中后各个阶段的装量的一致性，这也是我们值得深思的问题。
d、临床上
纳米晶在临床上时间周期比较长，投入比较大，时间周期越长，这个病例的脱落率也会越高，这样也会造成一些障碍。
另外，对于纳米晶来说，不同的注射部位它的吸收特征可能是不一致的，是不是我都要去考虑注射方式，带来临床用药的药代动力学的不同特点，这也是我们要关注的。
e、上市过程中
一方面是专利问题。另外从审评上，对于这类制剂的审评，不管是仿制还是改良，现在的标准我们都是对准FDA或者EMA，甚至有些方面可能更超过FDA或者EMA的一些要求。其实在审评这块还是我们面临很多的挑战，因为它是微观结构上的盲点比较多，所以导致CDE在审评审批中，会有很多的顾虑。
关于微球的立项思路方面，有哪些思路和建议？
吕丕平
微球
微球制剂
2022-12-14
对于二类制剂，它的开发周期相对是可控的，但是从立项的时候就要考虑它落地的可行性，所以在最初立项的时候不是简单的想法就去执行。我们首先要选择一个合适的适应症。合适的适应症需要考虑，第一，它是不是临床急需的，也就是为未来我们在做临床优势设计的时候能够做出来。这是关于品种问题。
第二个是这个产品里还要考虑它是不是需要长期给药。像糖尿病、镇痛类、精神类都需要长期给药，如果是一次给药结束，可能也不太适合开发成微球制剂，这是关于给药方式。
第三个，是给药途径。不管是原味凝胶、纳米晶还是微球，都是通过局部注射给药，所以我们就选择这类能够局部起效的药物作为候选的项目管线的API或者药物。
还有就是贡献生产问题。在做临床阶段的时候，尤其到NDA或者三期的时候，肯定只能考虑它是否可以跟其他品种贡献。
对于开发品种，不是做研发也不是做科学性的东西，选用的技术越简单越好，普适性越强越好。我们在选用这个技术的时候，技术转移人员在转移的时候工艺流程越短越好，用的设备越简单越好。我们在立项之初都要考虑整个工艺，每个阶段未来工业化要选用什么样的工艺，这个工艺是否具有可工业化的设备来选用。
最后要考虑这个产品是不是能赚钱，这个产品的市场空间有多大，总投资多少，总周期测算出来。
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